新疆一步法 TUNEL 原位细胞凋亡检测试剂盒（绿色，FITC）

产品包装

产品简介：

Y&KBIO 一步法 TUNEL 原位细胞凋亡检测试剂盒是一款灵敏度高且能快速简便的检测细胞凋亡的产品。本试剂盒适用于组织样本(新疆石蜡切片、新疆冰冻切片)和细胞样本(细胞涂片、细胞爬片)的原位凋亡检测，检测结果可通过荧光显微镜直接观察。

检测原理：

细胞在发生凋亡时，会激活一些特异性的 DNA 内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组 DNA。使得凋亡细胞的 DNA 被切割成 180~200bp 片段，在琼脂糖凝胶上通常以 180~200bp 的阶梯状迁移。TdT 酶（脱氧核糖核酸末端转移酶）将标记的 dUTP 连接到断裂 DNA 暴露的 3'-OH 末端，通过在这些末端添加荧光 dUTP 的方式来标记晚期凋亡细胞，从而可以通过荧光显微镜进行检测。

检测样本类型：细胞爬片/涂片    石蜡切片     冰冻切片

保存条件：-20°C 可保存一年，Labeling Solution 和 DAPI Reagent (25μg/mL)需避光保存。

自备试剂及新疆仪器

1) 细胞样本：

固定液：4%多聚甲醛。

通透液：Triton X-100 用 PBS 稀释至浓度为 0.2%。该溶液可提前 1~2 天配制并放在 4°C 保存。

2) 石蜡切片：

二甲苯、无水乙醇。

3) 冰冻切片：

固定液：4%多聚甲醛。

4) 其他试剂：

PBS、ddH2O、含抗荧光淬灭剂的封片液。

5) 仪器：

荧光显微镜。

试剂配制

1) 1×蛋白酶 K 工作液：取 1 μL Proteinase K (100×)加入 99 μL PBS 中，混匀。现用现配。

2) 1×DNase I Buffer 工作液：按照 9:1 的比例用 ddH2O 将 DNase I Buffer (10×)稀释待用。现配现用。

3) DNase I 工作液（200 U/mL）：用 1×DNase I Buffer 工作液，按照 99：1 稀释比将 DNase I (20 U/μL)稀释待用。现配现用。

    注：DNase I 会在剧烈混合下变性，建议不要涡旋 DNase I 溶液。

4) DAPI 工作液：取 4 μL DAPI Reagent(25 μg/mL)加入 96μL PBS 中混匀。现配现用。

固定与通透

1.细胞样本

1) 细胞爬片：将细胞爬片浸入 PBS 漂洗 1 次，滤纸吸干周围水分，再浸入固定液（自备），室温固定 15~20min 或 4°C 固定 1~2 h。

细胞涂片：收集细胞，加入一定体积的 PBS 重悬细胞沉淀，然后加入和 PBS 等体积的固定液（自备），室温固定 15~20 min 或 4°C 固定 1~2 h。600×g 离心 5 min，PBS 重悬，取 25~50 μL 细胞悬液涂片在载玻片上晾干。

   注：细胞固定是分析凋亡样本的重要步骤。未固定的细胞可能会丢失较小的 DNA 片段，导致较低的信号。

2) 固定好的样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。

3) 将样本浸入通透液（自备）中，37°C 作用 10 min。

4) 将通透好的样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。

2. 石蜡切片

1) 用常规方法将切片脱蜡水化。将切片浸入二甲苯（自备）脱蜡 2 次，每次 10 min；无水乙醇（自备）浸泡切片 2 次，每次 5 min；90%、80%、70%的乙醇水溶液（自备）各一次，每次 3 min。

    注：低温可能影响二甲苯脱蜡效果。当室温低于 20°C 时，二甲苯脱蜡时间可延长至 20 min。

2) 脱蜡好的样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。

3) 滤纸吸干切片组织周围的水分，每个样本上滴加 100 μL1×蛋白酶 K 工作液，37°C 反应 20 min。

    注：不同组织或物种的样本反应时间可能不同。建议进行预实验，确定反应时间。

4) 将通透好的样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。

3. 冰冻切片

1) 取出冰冻切片，平衡至室温，再浸入固定液（自备），室温（15~25°C）固定 30 min。

2) 固定好的样本浸入 PBS 漂洗 2 次，每次 5 min。

3) 每个样本上滴加 100 μL 1×蛋白酶 K 工作液，37°C 反应 10~20 min。

   注：不同组织或物种的样本反应时间可能不同。建议进行预实验，确定反应时间。

4) 将通透好的样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。

标记

1.分组设置

*TUNEL 检测时需设置阳性和阴性对照，以显示实验的客观性及准确性。建议在每次实验中设置阳性对照和阴性对照。

    注：阴性对照和阳性对照的制备可以同时进行。

阳性对照

1) 滴加 100 μL 1×DNase I Buffer 工作液到已通透的样本上,室温平衡 5 min。

2) 用吸水纸去除样本上多余的液体。加入 100 μL 稀释后的 DNase I 工作液（200 U/mL)，37°C 孵育 10~30min。

3) 样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。

阴性对照

1) 滴加 100 μL 1×DNase I Buffer 工作液到已通透的样本上,室温平衡 5 min。

2) DNase I Buffer 孵育阴性样本，37°C 孵育 10~30 min。

3) 样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。

实验组

  实验组通透完成后在 PBS 中静置，等待阳性对照和阴性对照处理后共同进行标记染色。

2. 标记工作液的配制

 计算好样本量集中配置，每个样本用量按照下表配制，充分混匀，现用现配。

注：

①　TdT Equilibration Buffer 使用前，室温静置直至完全溶解。冰冻的平衡液融化后可能会出现钴盐结晶，此为正常现象，可在使用前涡旋混匀。

②　Labeling Solution 使用前，请置于冰上溶解，待完全溶解后离心，并用枪头吹打混匀。

③　TdT Enzyme 对温度较敏感，请严格保存于-20°C，使用前取出，使用后立即放回。

④　配制标记工作液时，建议不要涡旋。

⑤　50 μL 标记工作液可覆盖的样本面积约为 5 cm2，对于表面积更大的样本可以成比例的增加工作液体积。

3. 标记步骤

1) 每个样本滴加 100 μLTdT Equilibration Buffer，37°C 湿盒中平衡 10~30 min。

2) 吸水纸吸除 TdT Equilibration Buffer（注意不要干片）。每个样本滴加 50 μL 标记工作液，放入湿盒中37°C 避光反应 60 min。

    注：如果信号强度较弱，则可延长 DNA 标记反应的培养时间。某些系统可能需要在 37°C 下反应 4 小时。

3) 样本浸入 PBS 漂洗 3 次，每次 5 min。

4) 吸水纸吸干水分后滴加 DAPI 工作液，室温避光孵育 5 min，对细胞核进行复染。

5) 样本浸入 PBS 漂洗 4 次，每次 5 min。

6) 用吸水纸吸干多余的液体，用含抗荧光淬灭剂（自备）的封片剂封片。

镜检观察

在荧光显微镜下选择合适的滤光片观察结果。

注：荧光易淬灭，请尽快观察拍照。若无法立即观察，请于 4°C 避光保存。